Bild 1: Massenspektrometrie unter P3 Grundriss des erweiterten P3-Labors 1 Schleuse 2 Durchreicheautoklav 3 Arbeit mit Mausprionen; Zellkultur 4 Arbeit mit humanen Prionen und BSE Material 5 Standort Massenspektrometer (LCQ Advantage; Finnigan) 6 Gefrierschränke für biologisches Material (-80¡C) 7 Fluchttüre

Bedingungen

Diverse Forschungsprojekte am Institut für Neuropathologie bedienen sich einer neuen Technologie zur quantitativen Bestimmung von Proteinkonzentrationen in ver-schiedenen biologischen Proben. Solche Experimente werden zur Zeit von unseren Mitarbeitern am Functional Genomics Center Zürich (FGCZ) durchgeführt. Quantitative Proteinanalysen von infektiösem Material müssen aber unter P3 Bedingungen erfolgen. Zu diesem Zweck wurde dem Institut für Neuropathologie vom FGCZ ein Massenspektrometer (LCQ Advantage, Thermo Finnigan; Bild 2) zur Verfügung gestellt. Um die geplanten Analysen durchführen und einen sicheren Betrieb der Anlage zu gewährleisten, müssen einige grundlegende technische Anpassungen vorgenommen werden, die der Sicherheit des Benutzers als auch der Umgebung dienen. Diese werden zur Zeit ausserhalb des P3-Labors in Zusammenarbeit mit der Herstellerfirma und unseren Mitarbeitern vorgenommen. Nach erfolgtem Umbau wird das Massenspektrometer definitiv im P3-Labor (Bild 1) aufgebaut und betrieben und wird Benutzern anderer Forschungsgruppen mit Experimenten derselben Biosicherheitsstufe zugänglich sein.

Bild 2: LCQ Advantage, Ion Trap Tandemmassenspektrometer von Thermo Finnigan

Erläuterung der wichtigsten wissenschaftlichen
Arbeiten im Jahr 2002

Prionen-Replikation in der Abwesenheit Toll-like Rezeptor
vermittelter Signaltransduktion
Prinz M./ Heikenwälder M./ Schwarz P./ Takeda K./Akira S./ Aguzzi A.

Prion replication in the absence of Toll-like receptor signalling.

Damit der infektiöse Erreger der Prionenkrankheiten von der Peripherie in das Gehirn des Trägers gelangen kann, muss es unterschiedliche Zellen und Kompartimente des Immunsystems (sekundär lymphatische Organe) kolonialisieren. Dort repliziert, gelangt es mit grösster Wahrscheinlichkeit über die peripheren Nerven in das Gehirn. Bis jetzt konnte jedoch nicht der Rezeptor identifiziert werden, welche die Aufnahme von infektiösen Prionen auf der Zielzelle ermöglicht. Toll-like Rezeptoren (TLRs) erkennen und binden spezifisch eine Vielzahl von Pathogenen und galten deshalb als möglicher Kandidat, über welchen das infektiöse Prionen Agens aufgenommen werden kann. Darüber hinaus wurde vor kurzem gezeigt, dass die Applikation von unmethyliertem CPG Oligonukelotiden, welche vor allem den Toll-like Rezeptor 9 (TLR9) stimuliert, die periphere Prionenpathogenese verlangsamt. Deshalb haben wir die Prionenpathogenese in MyD88-/- Mäusen untersucht, welche eine Defizienz in der TLR vermittelten Signaltransduktion aufweisen.

Trotz minimaler Defekte in der Milzarchitektur (Abbildung 1) konnten wir zeigen, dass MyD88-/- Mäuse vollkommen empfänglich für Prionen waren, sowohl nach intracerebraler als auch nach intraperitonealer Applikation (Tabelle 1 und Abbildung 2). Des Weiteren waren die Inkubationszeiten nach Prionenapplikation vergleichbar mit den Inkubationszeiten von C57BL/6 Kontrollmäusen (Tabelle 1). Der Titer an Prionen-Infektiösität in der Milz stieg auf ein vergleichbares Niveau mit einer zu den Kontrolltieren vergleichbaren Kinetik. Zusätzlich zeigten die Gehirne der MyD88-/- Mäuse die gleichen histopathologischen Veränderungen wie bei den Kontrolltieren (Abbildung 3). Zusammenfassend können wir berichten, dass TLR vermittelte Signaltransduktion keine entscheidende Rolle in der Prionenpathogenese spielt, und dass der protektive Effekt der TLR Stimulation aller Wahrscheinlichkeit nicht aus der direkten Interaktion mit dem infektiösen Prionen Agens resultiert.

Abbildung 1: Morphologie der Milz und deren Keimzentren in MyD88-/- und C57BL/6 Mäusen

Abbilddung 2: Western-blot Analyse von infizierten Milzen und Gehirnen entnommen aus MyD88-/- und C57BL/6 Mäusen.

Tabelle 1 als PDF: Hohe Anfälligkeit für das infektiöse Prionen Agens in MyD88-/- Mäusen nach peripherer und intracerebraler Inokulation.

Abbildung 3: Gehirnpathologie von terminal kranken Mäusen nach intraperitonealer Inokulation mit dem infektiösen Prionen Agens.

Das Fehlen des Prion-ähnlichen "Doppel"-Proteins
verursacht männliche Sterilität
Axel Behrens / Nicolas Genoud / Heike Naumann / Thomas Rülicke / Fredi Janett / Frank L. Heppner / Birgit Ledermann / Adriano Aguzzi

Absence of the prion protein homologue Doppel causes male sterility.

The EMBO Journal Vol. 21 No. 14 pp. 3652-3658, 2002
Man geht heute davon aus, dass das infektiöse Agens, welches Prionerkrankungen verursacht, identisch ist mit PrPSc, einer umgefalteten Form des normalen Prionproteins PrPc. PrPc-kockout Mäuse zeigen keine auffälligen pathologischen Veränderungen, was darauf zurückzuführen sein könnte, dass sie das sogenannte Doppel Protein exprimieren, welches eine signifikante biochemische und strukturelle Homologie mit PrPc aufweist. Um die physiologische Funktion von Doppel zu untersuchen, haben wir Mäuse mit einer homozygoten Deletion des Doppel-codierenden Prnd Gens generiert. Das Fehlen von Doppel hat keinen Einfluss auf die embryonale und postnatale Entwicklung, verursacht jedoch Sterilität männlicher Individuen. Das Doppel Protein wird in späten Stadien der Spermiogenese exprimiert, und die Spermatiden der Doppel-knockout Mäuse sind reduziert, unbeweglich, malformiert und können Oozyten in vitro nicht befruchten. Mechanische Dissection der Zona pellucida führte zu einer partiellen Wiederherstellung der Fertilität in vitro. Daraus schliessen wir, dass Doppel die männliche Fertiliät reguliert, indem es verschiedene Aspekte der männlichen Gametogenese und der Sperma-Ei Interaktion kontrolliert.

Das Prnd Gen, das für Doppel codiert, liegt 16 kb downstream des murinen Prnp Gens, ist wie dieses hoch konserviert und ist ein GPI-verankertes Membranprotein. Doppel mRNA wird stark exprimiert im Hoden, weniger stark in anderen peripheren Organen und lediglich in sehr geringem Masse im Gehirn adulter Wildtyp-Mäuse. Während der Embryogenese lässt sich hingegen eine signifikante Expression von Doppel mRNA nachweisen. Es konnte gezeigt werden, dass ektope Doppel Expression im Gehirn zu neuronaler Degeneration mit daraus resultierender Ataxie in Mäusen führt.

Um die physiologische Funktion des Doppel Proteins aufzuklären, haben wir Mäuse mit einer homozygoten gerichteten Deletion des Prnd Gens generiert. Während die entsprechenden Doppel knockout Weibchen vital und fertil sind, kommt es bei den Männchen ohne Doppel zu einer primären Sterilität. Wir konnten zeigen, dass die Sterilität der Doppel kockout Männchen nicht auf Verhaltensabnormalitäten, sondern auf einen Defekt in der Spermatogenese zurückzuführen ist.

Figure 1: Doppel wird in Spermatiden exprimiert. Histologische Analyse von Wildtyp (A,C) und Prndneo/neo (B,D) Hoden. Die Expression variiert zwischen verschiedenen Tubuli seminiferi, was eine stadienspezifische Expression nahelegt. Die Pfeile in (A) und (C) weisen auf die Doppel Immunreaktivität.

Weiterhin fanden wir heraus, dass Spermatiden in Abwesenheit des Doppel Proteins malformiert sind und einen Defekt in der Akrosomenfunktion aufweisen, woraus eine insuffiziente Oozytenfertilisation resultiert. Um diesen Defekt genauer zu untersuchen und die Rolle von Doppel in der Akrosomenfunktion näher zu beleuchten, haben wir in vitro Fertilisationsexperimente (IVF) durchgeführt. Dabei kamen wir zu dem Ergebnis, das eine Fertilisation von Oozyten durch Prndneo/neo Spermatozoen möglich ist, die Spermatozoen können jedoch die Barriere der Zona pellucida nicht überwinden.

Figure 2: Die Spermatozoen von Doppel-defizienten Mäusen sind malformiert. (A und B) Hellfeldaufnahmen von Spermatozoen aus Prnd+/+ (A) und Prndneo/neo (B) Mäusen. (C und D) Spermatozoen von Prnd+/+ (C) und Prndneo/neo (D) Mäusen, angefärbt mit Mitotracker zur Detektion von Mitochondrien (grün) und mit Hoechst als DNA Färbung (blau). (E-H) Hellfeldaufnahmen von Spermienköpfen von Prnd+/+ (E) und Prndneo/neo (F-H) Mäusen.

Auf diese Weise konnten wir Doppel als wesentliches regulatorisches Protein der männlichen Gametogenese identifizieren. Die Identifizierung genetischer Ursachen für männliche Infertilität hat praktische klinische Bedeutung. Es wäre interessant zu wissen, ob sich Doppel-Mutationen bei Infertilitätspatienten nachweisen lassen. Schliesslich sind unsere Ergebnisse auch in Hinblick auf die Entwicklung neuer Kontrazeptionsmethoden interessant, die Hemmung der Funktion von Doppel könnte ein neues therapeutisches Target darstellen.