Unsere Untersuchungen beschäftigen sich mit verschiedenen Eiweissfaltungskrankheiten wie beispielsweise dem Morbus Fabry (alpha-Galaktosidase A Mutationen, Abbildungen 2 und 3), dem renalen Diabetes insipidus (Aquaporin 2 Mutationen, Abbildung 5) und dem hereditären Emphysem (alpha-1-Antitrypsin Mutationen). Die Akkumulation der jeweilig betroffenen Eiweisse in der Zelle führt zur Aufregulierung von sogenannten Stressgenen. Es ist aber unklar, welche molekularen Mechanismen letztendlich zum Zellschaden führen. Hier liegt der Schwerpunkt unserer Untersuchungen an kultivierten Zellen (Abbildungen 3 und 5), die stabil transfiziert wurden, um korrekt oder nicht korrekt gefaltete Eiweisse zu exprimieren. Wir versuchen die Zusammenhänge zwischen Eiweissretention, dem Mechanismus des Abbaus nicht korrekt gefalteter Eiweisse (13) (Abbildungen 6 und 7), der möglichen Bildung von Einschlusskörpern (14) und dem Zellschaden aufzuklären. Kürzlich konnten wir nachweisen, dass die Retention nicht korrekt gefalteten Eiweisses an hochspezialisierten Stellen innerhalb der Zellen stattfindet (15).
Ein weiterer Schwerpunkt unserer Bemühungen liegt darin, den Faltungszustand der Eiweisse zu verbessern, so dass ein gewisser Prozentsatz an den eigentlichen Wirkungsort in der Zelle gelangen kann. Oftmals funktionieren nämlich die mutierten Eiweisse trotz der Faltungsdefekte und auf diese Weise könnten sich neue Therapieansätze eröffnen. Die Behandlung von Zellen mit sogenannten chemischen Chaperonen stellt ein erfolgsversprechendes Konzept dar, wie wir anhand unserer Experimente mit einem zellulären Modelsystem des Morbus Fabry nachweisen konnten (Abbildung 4). Hier liegt möglicherweise eine vielversprechende Alternative zur Enzymsubstitutionstherapie.

Dank

Unsere Untersuchungen werden von der Wolfermann-Nägeli-Stiftung, der Bonizzi-Theler Stiftung, der Kamillo Eisner-Stiftung, dem Schweizerischen Nationalfonds und dem Kanton Zürich grosszügig unterstützt.

Literatur

1. Ellgaard, L., Molinari, M., and Helenius, A. Setting the standards: Quality control in the secretory pathway. Science, 286: 1882-1888, 1999.
2. Roth, J., Zuber, C., Guhl, B., Fan, J. Y., and Ziak, M. The importance of trimming reactions on asparagine-linked oligosaccharides for protein quality control. Histochemistry Cell Biol, 117: 159-169, 2002.
3. Hebert, D. N., Foellmer, B., and Helenius, A. Glucose trimming and reglucosylation determine glycoprotein association with calnexin in the endoplasmic reticulum. Cell, 81: 425-433, 1995.
4. Jakob, C. A., Burda, P., teHeesen, S., Aebi, M., and Roth, J. Genetic tailoring of N-linked oligosaccharides: the role of glucose residues in glycoprotein processing of Saccharomyces cerevisiae in vivo. Glycobiology, 8: 155-164, 1998.
5. Parodi, A. J. Protein glucosylation and its role in protein folding. Annu Rev Biochem, 69: 69-93, 2000.
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7. Liu, Y., Choudhury, P., Cabral, C. M., and Sifers, R. N. Oligosaccharide modification in the early secretory pathway directs the selection of a misfolded glycoprotein for degradation by the proteasome. J Biol Chem, 274: 5861-5867, 1999.
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9. Zuber, C., Fan, J. Y., Guhl, B., Parodi, A., Fessler, J. H., Parker, C., and Roth, J. Immunolocalization of UDP-glucose: glycoprotein glucosyltransferase indicates involvement of pre-Golgi intermediates in protein quality control. Proc Natl Acad Sci USA, 98: 10710-10715, 2001.
10. Zuber, C., Spiro, M. J., Guhl, B., Spiro, R. G., and Roth, J. Golgi apparatus immunolocalization of endomannosidase suggests post-endoplasmic reticulum glucose trimming: Implications for quality control. Mol Biol Cell, 11: 4227-4240, 2000.
11. Roth J, Ziak M, Zuber C: (2003) The role of glucosidase II and endomannosidase in glucose trimming of asparagine-linked oligosaccharides. Biochimie 85:287-294
12. Aridor, M. and Hannan, L. A. Traffic jams II: An update of diseases of intracellular transport. Traffic, 3: 781-790, 2002.
13. Hirano, K., Zuber, C., Roth, J., and Ziak, M. The proteasome is involved in the degradation of different aquaporin-2 mutants causing nephrogenic diabetes insipidus. Am J Pathol, 163:111-120 2003.
14. Hirano, K., Roth, J., Zuber, C., and Ziak, M. Expression of a mutant ER-retained polytope membrane protein in cultured rat hepatocytes results in Mallory body formation. Histochemistry Cell Biol, 117: 41-53, 2002.
15. Zuber C, Fan J-Y, Guhl B, Roth, J: (2003) Misfolded proinsulin accumulates in expanded pre-Golgi intermediates and endoplasmic reticulum subdomains in Akita mice beta cells. FASEB J., in press, 2004

Krebsregister des Kantons Zürich
Abteilung Molekulare Epidemiologie
Dr. phil. II et Ph.D. Nicole Probst-Hensch

Das Krebsregister des Kantons Zürich sowie die Abteilung Molekulare Epidemiologie werden in Zusammenarbeit zwischen dem Departement Pathologie des USZ und dem Institut für Sozial- und Präventivmedizin der Universität Zürich geführt. Führung und Ausbau der Registers und der Abteilung Molekulare Epidemiologie werden im Lenkungsausschuss koordiniert (Proff. Dres. med. Ph. U. Heitz und F. Gutzwiller; Frau Dr. N. Probst).

Im Berichtsjahr wurden am Krebsregister pathologische Befunde von Krebspatienten im Kanton Zürich für die Jahre 1998 bis 2001 erfasst und abstrahiert. Die erfassten Krebsdiagnosen für die Jahre 1997 bis und mit 1999 wurden codiert. Für Mammakarzinome ist die Codierung bis und mit 2000 abgeschlossen. Diese Daten stehen jetzt für vergleichende Überlebensanalysen in Zusammenarbeit mit Krebsregistern anderer Kantone zur Verfügung. Als nach wie vor schwierig gestaltet sich die Inzidenzerhebung, da der bevölkerungsbezogene Datenzugang trotz Regierungsratsauftrag noch immer nicht gewährleistet ist. Entsprechend wurden einerseits Abklärungen betreffend eine mögliche Verbesserung der rechtlichen Grundlage für die Krebsregistrierung in die Wege geleitet, andererseits wird zur Zeit intensiv über die Rolle des Krebsregisters im Rahmen einer Tumorbank in Zürich nachgedacht. Zielsetzung für das Krebsregister Zürich muss sein, dass den Anforderungen an ein modernes Register Rechnung getragen wird. Die Tumordokumentation muss dementsprechend weit über die Inzidenzerfassung hinausgehen, sondern auch Überlebensanalysen in Abhängigkeit von Stadium bei der Diagnose, molekularen Markern und Therapie erlauben. Des weiteren soll das Krebsregister auch die Basis bilden für die Durchführung molekular-epidemiologischer Fall-Kontrollstudien.

Zu den Haupttätigkeiten der Abteilung Molekulare Epidemiologie gehört die Untersuchung des Zusammenspiels genetischer und exogener/modifizierbarer Faktoren in der Entstehung von chronischen Erkrankungen, insbesondere von Krebserkrankungen und respiratorischen/allergischen Erkrankungen. Zielsetzung dieser Forschung ist die verbesserte Identifizierung molekularer Abläufe und modifizierbarer Risikofaktoren in der Krebsätiologie. Die Resultate der Forschungstätigkeit sollen zu einer individualisierteren und gezielteren primären und sekundären Prävention führen. Die Habilitation von Dr. Nicole Probst auf dem Gebiet der molekularen Epidemiologie wurde im Berichtsjahr eingereicht.
Im Bereich der Krebserkrankungen wird das Zusammenspiel von Lebensstilfaktoren, Ernährung, und genetischer Variabilität (im Bereich Sexsteroid-Hormone, Wachstumsfaktoren, Zellzyklus) anhand von Daten grosser Kohortenstudien in den USA, China und Singapore in Zusammenarbeit mit der University of Southern California untersucht. Im Berichtsjahr konnte anhand von Untersuchungen zu Polymorphismen im IGF-1 Gen und zu Blutkonzentrationen von IGF-1, IGF-2 und IGFBP-3 die Hypothese gestärkt werden, dass das Insulin-like Growth Factor System in der Brust- und Darmkrebsentstehung von Bedeutung ist. Desweiteren wurde ein Projekt zum Zusammenhang zwischen genetischer Variabilität im Bereich des Cyclin D1 Gens und verschiedenen Krebsarten im Rahmen der Singapore Chinese Health Study initiiiert. Für diese Zusammenarbeit konnten einerseits finanzielle Mittel aus den USA gewonnen werden, andererseits ist es dank finanzieller Unterstützung durch den Schweizerischen Nationalfonds und die Krebsliga des Kantons Zürich möglich, eine Assistenzärztin anzustellen, die das Projekt vor Ort in Los Angeles auswertet und die Daten publiziert. Die Assistenzärztin wird im Anschluss an ihre Weiterbildung am Krebsregister tätig werden, um den Bereich molekulare Krebsepidemiologie weiter ausbauen zu helfen.
Im Bereich der respiratorischen Erkrankungen wird das Zusammenspiel genetischer Faktoren mit Rauchen, Luftschadstoffexposition und anderen Risikofaktoren anhand der SAPALDIA Studie untersucht (www.medgen.unizh.ch/Pages/sapaldiaIMG_D.html; www.sapaldia.ch). Die SAPALDIA Kohorte wurde erstmals 1991 und 11 Jahre später wieder untersucht und befragt. Von den ursprünglich rund 10’000 gesunden Probanden nahmen mehr als 7’000 auch an der Folgeuntersuchung wieder teil. Dr. N. Probst-Hensch ist als Mitgesuchstellerin des vom Schweizerischen Nationalfonds mitgetragenen Projektes verantwortlich für die Biobank und den Bereich Genetik. Damit steht eine weltweit einzigartige Biobank in diesem Bereich zur Verfügung, welche es über die nächsten Jahre erlauben wird, zahlreichen Fragestellungen innerhalb aber auch ausserhalb des Bereiches respiratorische Erkrankungen nachzugehen. Im Berichtsjahr 2002 wurde in Zusammenarbeit mit dem Institut für Medizinische Genetik in Schwerzenbach (Prof. W. Berger) unter der Leitung von Dr. Nicole Probst mit dem Aufbau der DNA-Bank begonnen; DNA wurde aus den Blutproben von über 5000 Probanden extrahiert. Gleichzeitig wurde die SAPALDIA Plasma/Serum-Probenbank, welche zur Zeit in Genf lokalisiert ist, mit über 250’000 Blutaliquots in 2 identische Biobanken aufgesplittet. Die eine Biobank wird in Zusammenarbeit mit dem Institut für Klinische Chemie (Prof. A. von Eckardstein) am Universitäts-Spital etabliert. Unter anderem vor dem Hintergrund der SAPALDIA Proben baut das UniversitätsSpital Zürich zur Zeit den verfügbaren Kühlraumplatz aus. Das Hauptaugenmerk der Forschung im Bereich SAPALDIA wird sich anfänglich auf die Bedeutung genetischer Variablilität in den Bereichen oxidativer Stress/Lungenfunktion, Zytokine/Atopien, alpha-1-Antitrypsin und Lungenfunktion, sowie Übergewicht/Lungenfunktion/Gewichtsveränderung richten. In Zusammenarbeit mit dem Krebsforschungszentrum in Heidelberg wurden im Berichtsjahr 450 DNA Proben der SAPALDIA Studie auf Polymorphismen in 10 Zytokin-Genen untersucht; der Zusammenhang der genetischen Varianten mit Heuschnupfen und Atopien wird zur Zeit statistisch ausgewertet. Beim Schweizerischen Nationalfonds wurde ein Gesuch zur Untersuchung von genetischer Variabilität im Bereich oxidativer Stress im Rahmen der SAPALDIA Studie eingereicht (Hauptgesuchstellerin: N. Probst). Die Lungenliga Zürich hat Startkapital zur Verfügung gestellt für die Untersuchung des Zusammenhanges zwischen alpha-1-Antitrypsin-Konzentrationen im Blut von Rauchern und der Entwicklung der Lungenfunktion über 11 Jahre; weitere Gesuche zu dieser Forschungsfrage wurden bei verschiedenen Stiftungen eingereicht.

Für die Umsetzung dieser Projekte konnte auf Anfang 2003 1 Molekularbiologin und 1 Laborantin über Drittmittelfinanzierung angestellt werden. Auf den 1.1.2004 wird ein zusätzlicher Assistenzarzt über Drittmittelfinanzierung für das alpha-1-Antitrypsin-Projekt angestellt werden.

Dr. Nicole Probst ist Mitgesuchstellerin für die Erarbeitung eines Berichtes zum Thema Pharmakogenomik, der von Zentrum für Technologie-Folgenabschätzung ausgeschrieben wurde. Das Gesuch, das unter der Leitung von Dr. Klaus Peter Rippe (Ethik im Diskurs) in einem interdisziplinären Team erarbeitet wird, wurde im Berichtsjahr finanziert. Der Berichtsabschluss fällt in das Berichtsjahr 2004.

Abbildung 1. Schematische Darstellung des Zusammenhangs zwischen Qualitätskontrolle der Eiweissfaltung, Zuckerseitenkettenstruktur, Enzymen (Glukosidase II, Glukosyltransferase) und Lektinen (Calnexin/Calreticulin). Die mit 1 bezeichnete Zuckerseitenkettenstruktur ist förderlich für die Eiweissfaltung, während die mit 2 bezeichnete ein Signal für den Abbau nicht korrekt gefalteter Glykoproteine darstellt.

Abbildung 2. Elektronenmikroskopischer Nachweis der lysosomalen Speicherung in einer kleinen Arterie eines Patienten mit Morbus Fabry. Die elektronendichten Ablagerungen in den Lysosomen (*) einer Endothelzelle und einer glatten Muskelzelle sind offensichtlich.

Abbildung 3. Kultivierte transgene Mausfibroblasten als in vitro Model für den Morbus Fabry. Konfokale Doppelimmunfluoreszenz für alpha-Galaktosidase A (grüne Fluoreszenz) und den lysosomalen Membranmarker LAMP 1 (rote Fluoreszenz). (a) In Fibroblasten, die normale alpha-Galaktosidase A exprimieren ist das Enzym vorwiegend in den Lysosomen nachweisbar (gelbe Mischfluoreszenz). (b) In Fibroblasten, die R301Q alpha-Galaktosidase A exprimieren verbleibt das mutierte Enzym im endoplasmatischen Retikulum und ist nicht in den Lysosomen detektierbar (Abwesenheit einer gelben Mischfluoreszenz). Die Blaufluoreszenz dient zur Darstellung der Zellkerne.

Abbildung 4. Die Behandlung der R301Q alpha-Galaktosidase A exprimierenden Fibroblasten mit dem spezifischen Enzymhemmer führt zu einer dosis- und zeitabhängigen Verlagerung des mutierten Enzyms aus dem endoplasmatischen Retikulum in Lysosomen. (a, b) Nach zweitägiger Behandlung ist mutierte alpha-Galaktosidase A sowohl im endoplasmatischen Retikulum (grüne Fluoreszenz) als auch in einigen Lysosomen (gelbe Mischfluoreszenz) nachweisbar. (c, d) Die Zahl der Lysosomen, die mutierte alpha-Galaktosidase A enthalten ist nach viertägiger Behandlung deutlich erhöht.

Abbildung 5. Kultivierte Clone 9 Hepatozyten als in vitro Model für den renalen Diabetes insipidus verursacht durch Mutationen des Aquaporin 2 Wasserkanals. Konfokale Doppelimmunfluoreszenz für (a) T126M Aquaporin 2 (rote Fluoreszenz), und (b) den Golgi Apparat Marker Mannosidase II (grüne Fluoreszenz) demonstriert die Retention des mutierten Aquaporin 2 im endoplasmatischen Retikulum (c).

Abbildung 6. Vergleich der Biosynthese und des Umsatzes von normalen (Wt) und mutierten (T126M) Aquaporin 2. Obwohl Wt und T126M Aquaporin 2 in einer 32 kDa glykosilierten und einer 29 kDa nicht glykosilierten Form synthetisiert werden, unterscheiden sich ihre Halbwertszeiten drastisch.

Abbildung 7. Der intrazelluläre Abbau des T126M Aquaporin 2 kann durch Proteasomenhemmer (Lactacystin, MG132 und ALLN) blockiert werden. Der Lysosomenhemmer Chloroquin hat keinen Einfluss. Somit unterliegt das im endoplasmatischen Retikulum zurückbehaltene T126M Aquaporin 2 der Qualitätskontrolle mit nachfolgendem nicht-lysosomalen Abbau durch Proteasomen.

Eckdaten
	Forschungsschwerpunkte Die Forschungsschwerpunkte sind Tumorentstehung, neurodegenerative Erkrankungen, Immunologie, Aufbau und Funktion der extrazellulären Matrix, Eiweissqualitätskontrolle, molekulare Epidemiologie von Tumoren und Erkrankungen der Atemwege. Lehre Ausbildung in Allgemeiner und Spezieller Pathologie von Studierenden der Medizin und Umweltnaturwissenschaften der ETH. Intensive Aus-, Weiter- und Fortbildung des ärztlichen und technischen Personals. Anzahl Mitarbeitende des gesamten Departements 146,5 Stellen Anzahl Mitarbeitende der departementalen Abteilungen und Labors, ohne Drittmittelfinanzierung 26 Stellen

Portraits

Dr. phil II et Ph.D. Nicole Probst-Hensch Leiterin Krebsregister		Prof. Dr. med. Dr. sc. Jürgen Roth Abteilungsleiter Zell- und Molekularpathologie		Dr. phil II Dipl. Biol. Martin Ziak Oberassistent Zell- und Molekularpathologie
Dipl. Biol. Christian Zuber Oberassistent Zell- und Molekularpathologie